معنی دقیق HER2-low و HER2-ultralow در گزارش جدید پاتولوژی سرطان پستان چیست؟

ملاحظات پیش‌آنالیتیک (Preanalytical)

این موارد همان توصیه‌های مرسوم برای تشخیص HER2-positive است، ولی اهمیت آن‌ها در تفکیک 0 از 0+ بیشتر است، زیرا خطای کوچک ممکن است یک مورد ultralow را null نشان دهد:

• Cold ischemia time کمتر از 1 ساعت.
• تثبیت در 10% neutral-buffered formalin به مدت 6 تا 72 ساعت (حداکثر 96 ساعت).
• استفاده از آخرین نمونه‌ی FFPE و برش‌های تازه (ضخامت 4 میکرون). برش‌های قدیمی‌تر از حدود 6 هفته ممکن است آنتی‌ژنیسیته‌ی کمتری داشته باشند.
• کنترل‌ها ترجیحاً هم‌زمان با نمونه برش داده شوند و on-slide external control با سطوح مختلف بیان توصیه می‌شود.
• در بیماری متاستاتیک، در صورت امکان بیوپسی تازه تهیه شود.
• FNA و استخوان دکلسیفیه‌شده برای ارزیابی HER2-low/ultralow مناسب نیستند. در cell block هم background اجازه‌ی ارزیابی دقیق 0+ یا 1+ را نمی‌دهد. اگر نمونه‌ی دیگری نباشد می‌توان آن را تست کرد، اما «نبودِ رنگ‌پذیری» قابل‌اعتماد نیست.
• بازبینی لام‌های IHC آرشیوی (مثلاً قدیمی‌تر از 5 سال) که قبلاً 0 گزارش شده‌اند توصیه نمی‌شود، چون ایمونوراکتیویته با گذر زمان محو می‌شود و یک ultralow واقعی ممکن است null به نظر برسد.

انتخاب نمونه و تست مجدد

HER2-low می‌تواند بین core biopsy و نمونه‌ی جراحی، تومور اولیه و متاستاز، و حتی بین محل‌های مختلف متاستاتیک یا زمان‌های متفاوت ناهمگن (discordant) باشد. طبق راهنمای فعلی، اگر هر یک از نمونه‌های بیمار در طول سیر بیماری HER2-low باشد، بیمار برای T-DXd قابل‌بررسی است. به همین دلیل:

• تست مجدد عموماً لازم نیست.
• اگر نمونه‌ی اولیه «HER2 0» گزارش شده و null را از ultralow تفکیک نکرده، و انکولوژیست بیمار را کاندید T-DXd می‌داند، می‌توان لام اخیر را (در صورت کمتر از 5 سال) دوباره امتیازدهی کرد، یا بلوک آرشیوی را مجدداً رنگ‌آمیزی کرد.
• اگر ابهام ادامه یافت، بلوک‌های دیگر از همان محل یا محل‌های دیگر بررسی شوند. آزمودن 2 تا 3 نمونه قابل‌قبول است.
• در بیماری پیشرونده یا باقی‌مانده پس از درمان نئوادجوانت نیز تکرار تست به‌دلیل تغییرات بیان HER2 قابل‌توجه است.

ملاحظات آنالیتیک: انتخاب آنتی‌بادی و پروتکل

• در کارآزمایی‌های T-DXd از VENTANA HER2 (4B5) و سیستم ultraView روی برش‌های 4 میکرونی استفاده شد.
• مقاله تصریح می‌کند فقط assay دارای تأیید FDA به‌عنوان companion diagnostic نتایج DB-04 را بازتولید می‌کند. Roche نسخه‌ی به‌روز و locked پروتکل PATHWAY anti-HER2 (4B5) را برای HER2-low/ultralow معرفی کرده است. پارامترهایی مانند CC1 conditioning و زمان انکوباسیون آنتی‌بادی اولیه (ثابت‌شده روی 12 دقیقه) دیگر قابل تغییر نیستند و رعایت این پروتکل برای تعیین واجد شرایط بودن برای T-DXd الزامی است.
• برخی assayهای دیگر ممکن است حساسیت آنالیتیک بالاتری داشته باشند، اما چون داده‌ی بالینی پیامد برای آن‌ها وجود ندارد، مقایسه‌ها باید به عملکرد آنالیتیک محدود بماند، نه فرض سود بالینی معادل. آزمایشگاه‌هایی که از assay دیگر استفاده می‌کنند بهتر است cross-validation رسمی با پلتفرم 4B5 انجام دهند و در EQA اختصاصی HER2-low/ultralow شرکت کنند.
• روش‌های کمّی (مانند HERmark، AQUA، IHC کمّی و بیان mRNA) هنوز برای استفاده‌ی بالینی تأیید نشده‌اند.

کنترل‌ها (Controls)

در هر run باید کنترل داخلی و خارجی وجود داشته باشد و کنترل‌ها کل دامنه‌ی بیان را پوشش دهند (0، 1+، 2+، 3+):

• مثبت: رده‌های سلولی 3+ مثل SK-BR-3 و BT-474، یا بافت 3+.
• Null: مثل MDA-MB-231 یا بافت HER2-null. MCF-7 معمولاً null است ولی گاهی بیان کم (1+) نشان می‌دهد.
• Low: بلوک FFPE تومور تأییدشده‌ی 1+ یا 2+ یا رده‌های سلولی مانند T-47D، ZR-75-1 و MDA-MB-175. در MDA-MB-175 نباید brush border لومینال و نقطه‌ نقطه شدن گلژی را امتیاز داد.
• Ultralow: در حال حاضر رده‌ی سلولی اختصاصی وجود ندارد؛ از بافت تومور با نسبت نسبتاً بالای رنگ‌پذیری faint استفاده شود.
• سلول‌های اپیتلیال طبیعی داخل لام به‌عنوان کنترل داخلی ارزشمندند. رنگ‌پذیری weak در سطح basolateral لوبول‌های نرمال گاهی قابل‌قبول است، اما رنگ‌پذیری بیش از weak یا complete circumferential نشانه‌ی overstaining است.
• استفاده از IHC calibratorها (میکروبید‌های پوشش‌داده‌شده) برای کمّی‌سازی حد تشخیص و دامنه‌ی دینامیک، به‌ویژه با تغییر lot آنتی‌بادی یا سیستم detection، توصیه شده است.

---

تفسیر و امتیازدهی (Postanalytical)

• ارزیابی بر پایه‌ی شدت، کامل بودن غشا (completeness) و درصد سلول‌های رنگ‌گرفته انجام می‌شود، مطابق الگوریتم ASCO/CAP.
• رنگ‌پذیری گرانولار سیتوپلاسمی (مثلاً در تمایز آپوکرین) و هسته‌ای پیش‌بینی‌کننده‌ی پاسخ نیست و نباید امتیاز داده شود.
• فقط سلول‌های تومور مهاجم و زنده ارزیابی شوند. نکروز، کارسینوم in situ و artifactهای رنگ‌پذیری (مثل edge artifact، رنگ‌پذیری apical/luminal یا محیطی خوشه‌های سلولی بدون الگوی بین‌سلولی) را نباید امتیاز داد. اگر artifact دیده شد یا کنترل 1+ ضعیف رنگ گرفته بود، رنگ‌آمیزی مجدد برای تفکیک null از ultralow توصیه می‌شود.

قاعده‌ی بزرگ‌نمایی (Magnification rule)

• Strong: در بزرگ‌نمایی خیلی کم دیده می‌شود و باید با کنترل 3+ همخوان باشد.
• Moderate: ممکن است در بزرگ‌نمایی کم دیده شود و با مقایسه با کنترل 3+ از strong جدا می‌شود.
• Weak: با ابجکتیو ×20 قابل تشخیص است و گاهی در ×10.
• Faint: barely perceptible؛ فقط در ×40 دیده می‌شود و در بزرگ‌نمایی پایین‌تر دیده نمی‌شود.

بررسی باید از بزرگ‌نمایی کم به زیاد پیش برود. در کارآزمایی‌ها، موارد indeterminate با ابجکتیو ×40 یا بالاتر ارزیابی شدند.

تعداد سلول‌ها و ناهمگنی

• برای ISH ارزیابی 20 تا 60 سلول مهاجم کافی است.
• برای تفکیک IHC 0، 0+ و 1+ بهتر است دست‌کم 100 سلول مهاجم بررسی شود.
• در تومور ناهمگن، نسبت هر الگو برآورد می‌شود و امتیاز نهایی بر اساس بالاترین دسته است، با توضیح درباره‌ی درصد سلول‌های رنگ‌گرفته.
• اگر کلون‌های متمایز HER2-positive و HER2-negative وجود دارد، باید ذکر شود.
• اگر تعداد سلول‌های تومور بسیار کم است و رنگ‌پذیری غشایی دیده نمی‌شود، گزارش باید چنین باشد: «HER2 uncertain، به‌دلیل کافی نبودن تعداد سلول‌های تومور برای ارزیابی دقیق» و در صورت مدنظر بودن T-DXd، نمونه‌برداری مجدد توصیه شود. اگر رنگ‌پذیری غشایی بی‌ابهام وجود دارد، می‌توان نوشت «اگرچه سلول‌های تومور اندک‌اند، امتیاز دست‌کم برابر … است».

الگوریتم ISH در 2+

• طبق راهنمای UK: ISH مثبت است اگر نسبت HER2/CEP17 ≥ 2.0 یا میانگین HER2 copy number ≥ 6.0 سیگنال در هر سلول.
• طبق ASCO/CAP: نسبت ≥ 2.0 همراه با میانگین copy number ≥ 4.0، یا میانگین copy number ≥ 6.0.

نحوه‌ی گزارش‌دهی

1. امتیاز IHC (0، 0+، 1+، 2+ با نتیجه‌ی ISH، یا 3+) طبق ASCO/CAP گزارش شود.
2. روش شامل کلون آنتی‌بادی یا پروب ISH، پلتفرم و پروتکل ذکر شود.
3. به‌صورت اختیاری، دسته‌ی بالینی (null، ultralow، low) داخل پرانتز یا به‌صورت کامنت اضافه شود.
4. به‌صورت اختیاری، توصیف کوتاه الگو، شدت و درصد تقریبی سلول‌های رنگ‌گرفته آورده شود.
5. در صورت نیاز، کامنت اختیاری CAP درباره‌ی اهمیت بالینی بیان کم HER2 و تعریف دسته‌های HER2-low و ultralow در کارآزمایی‌ها افزوده شود.

بر اساس قالب جدید CAP (اجرایی از مارس 2025) چهار طبقه‌ی HER2-negative ثبت می‌شود: 0، 0+، 1+ و 2+/ISH-negative. پس از ISH، هر تومور در یکی از چهار دسته‌ی نهایی قرار می‌گیرد: positive، low، ultralow یا null. استفاده از synoptic templateهای CAP برای یکنواختی گزارش‌ها توصیه شده است.

---

چالش‌های اصلی: چرا تفکیک 0 از 0+ سخت است؟

• در DB-06، در بازبینی مرکزی تومورهای HR-positive که محلی IHC 0 گزارش شده بودند، 35٪ واقعاً null، 40٪ ultralow و 24٪ در حد 1+ بودند. یعنی حدود 64٪ از موارد «0» تغییر دسته دادند، هرچند آزمایشگاه‌های محلی در آن زمان ملزم به تفکیک null از ultralow نبودند.
• مطالعات متعدد interobserver agreement پایینی را بین پاتولوژیست‌ها در تفکیک زیرگروه‌های HER2-negative نشان داده‌اند. نویسندگان اذعان می‌کنند این تفکیک همیشه امکان‌پذیر نیست و misclassification گاهی اجتناب‌ناپذیر است.
• ناهمگنی مکانی و زمانی HER2 احتمال نتیجه‌ی منفی کاذب را بالا می‌برد.
• تنها بخش نسبتاً کوچکی از بیماران واقعاً کاندید T-DXd می‌شوند، چون کاربرد آن به بیماری متاستاتیک و معیارهای بالینی (درمان‌های قبلی، performance status) محدود است.

به همین دلیل، اگر بیماری کاندید T-DXd است و گزارش قبلی صرفاً «HER2-negative» ذکر کرده، گفت‌وگوی مستقیم پاتولوژیست و انکولوژیست درباره‌ی بازبینی یا تست مجدد ضروری است.

هوش مصنوعی و پاتولوژی دیجیتال

الگوریتم‌های AI می‌توانند درصد سلول‌های رنگ‌گرفته، شدت و completeness را کمّی کنند، ولی:

• در متاآنالیز ذکرشده، sensitivity برای 3+ حدود 0.97، برای 2+ حدود 0.89 و برای 1+ حدود 0.69 بود. یعنی عملکرد در انتهای پایین طیف ضعیف‌تر است.
• مشکل ground truth در 0+ و 1+ به‌دلیل تغییرپذیری بالای بین‌ناظرین جدی است و پراکندگی بین الگوریتم‌ها مشابه پراکندگی بین پاتولوژیست‌هاست.
• AI مشکلات پیش‌آنالیتیک، تثبیت و ناهمگنی تومور را حل نمی‌کند و نظارت پاتولوژیست برای حذف نواحی نامناسب (مثل in situ) ضروری است.
• ابزارها باید روی کوهورت‌هایی معتبرسازی شوند که HER2-low و ultralow به‌اندازه‌ی کافی در آن‌ها حضور دارد.
• زیرساخت دیجیتال و هزینه‌ی لایسنس در بسیاری از مراکز مانع است.

توصیه‌ی مقاله: AI فقط ابزار کمکی باشد و جایگزین قضاوت تخصصی پاتولوژیست نشود.

خلاصه‌ی اقدامات کنترل کیفیت

1. استانداردسازی هندلینگ و تثبیت بافت.
2. استفاده از assayهای IHC معتبر.
3. کنترل‌های داخلی و خارجی با دامنه‌ی 0 تا 3+.
4. اعتبارسنجی عملکرد assay در کوهورت‌های HER2-low/ultralow و HER2-positive.
5. گزارش با 5 دسته‌ی IHC: 0، 0+، 1+، 2+ و 3+.
6. ارزیابی تومورهای 2+ با ISH.
7. گزارش‌دهی استاندارد (مثل synoptic CAP) و پایش اختلاف‌ها.
8. آموزش پاتولوژیست‌ها.
9. شرکت در برنامه‌های EQA.
10. ارتباط مؤثر انکولوژیست و پاتولوژیست.
11. ممیزی (audit) منظم و مقایسه با مرجع.
12. گزارش دوگانه (double reporting) در موارد مبهم و چالش‌برانگیز.

---

نکات کلیدی

• «HER2-negative» باید به null، ultralow و low تفکیک شود، به‌ویژه وقتی بیمار متاستاتیک و کاندید T-DXd است.
• تفکیک null از ultralow به حضور یا فقدان رنگ‌پذیری faint و incomplete در ≤10٪ سلول‌ها وابسته است و حساس‌ترین بخش این طبقه‌بندی از نظر تکنیکی و تفسیری است.
• ultralow در DB-06 مربوط به تومورهای HR-positive تعریف شده است.
• کیفیت پیش‌آنالیتیک، پروتکل locked دستگاه 4B5، کنترل‌های چندسطحی و آموزش، پایه‌ی گزارش قابل‌اعتماد هستند.
• در موارد مبهم: double reporting، تست بلوک دیگر یا ISH.

---

ارجاع کامل:
Rakha EA, Tan PH, Van Bockstal MR, Allison KH, Brogi E, Callagy G, et al. International Expert Consensus Recommendations for HER2 Reporting in Breast Cancer: Focus on HER2-Low and Ultralow Categories. Modern Pathology. 2026;39:100925. doi:10.1016/j.modpat.2025.100925. مقاله‌ی دسترسی‌آزاد تحت مجوز CC BY 4.0.