لوسمی حاد و ارزیابی MRD در BCP-ALL

در این مطلب به بررسی لوسمی های حاد و ارزیابی MRD در BCP-ALL خواهیم پرداخت. پیشنهاد میکنیم اگر مطلب قبلی که بخش اول و مقدمه این مطلب، با موضوع تشخیص و ارزیابی لوسمی حاد و MRD است را نخوانده اید از اینجا بخوانید. همانگونه که در قسمت قبل توضیح داده شد، لوسمی حاد ناشی از گسترش کلونال پیش‌سازهای نابالغ سلول ‌های خون‌ساز بوده و به دو گروه اصلی تقسیم می ‌شوند که عبارتند از:

• نئوپلاسم پیش‌سازهای لنفوئیدی
• لوسمی میلوئیدی حاد (AML) و پیش‌سازهای مرتبط با آن.

در این قسمت به توضیح نقش ایمونوفنوتایپینگ در روند تشخیص و ارزیابی لوسمی حاد و به ویژه روش های تشخیصی MRD با قدرت بالا می پردازیم. بدین منظور در ادامه مطلب در رابطه با پنل 8 رنگ طراحی و استاندارد شده جهت تشخیص MRD در BCP-ALL می پردازیم.

فلوسایتومتری و نقش آن در ایمونوفنوتایپینگ لوسمی حاد

فلوسایتومتری دارای نقش به‌سزایی در روند تشخیص و طبقه‌بندی لوسمی‌ های حاد از طریق تعیین رده سلول ‌های نابالغ (Blast cells) در نمونه ‌های مشکوک می ‌باشد. در سال‌ های اخیر ایمونوفنوتایپینگ با استفاده از فلوسایتومتری امکان طبقه‌بندی لوسمی ‌ها، تعیین شاخصه های کارآمد در پیش آگهی لوسمی ‌ها، اهداف درمانی و ارزیابی MRD را فراهم نموده ‌است. گروه EuroFlow^TM  اقدام به طراحی یک پنل متشکل از 8 آنتی‌ بادی برای تشخیص، طبقه‌بندی و ردیابی لوسمی ‌های حاد طراحی نموده که می ‌توان از آن در کنار ابزار جدید Infinicyt^TM  جهت تعیین ویژگی ‌های ایمونوفنوتیپی چندبعدی سلول‌ های بلاست استفاده نمود. پنل ‌ها به‌منظور پاسخ به شمار متعدد پرسش‌ های پیش‌آمده حین کار طراحی شده و بدین‌ترتیب پنل 8 رنگ ذکرشده جهت کمک به شناسایی و تعیین سلول ‌های B پاتولوژیک باقیمانده در بدن بیمار مبتلا به BCP-ALL MRD طراحی شده ‌است. پنل BCP-ALL-MRD طراحی ‌شده توسط EuroFlow^TM  شامل 8 آنتی ‌بادی و دستورالعمل ‌های  آزمایشگاهی با هدف دستیابی به حساسیت  10^-6 و دارای قابلیت مقایسه با روش RQ-PCR  در شناسایی MRD می‌باشد. پنل موردنظر شامل دو تیوب با چندین مارکر مشترک می‌ باشد. در میان آن ‌ها CD19، CD45، CD34، CD10 و CD20 در گیتینگ صحیح BCP به ‌کار رفته و به‌عنوان مارکرهای اصلی در گیتینگ اولیه به ‌شمار می‌ آیند. همچنین این مارکرها امکان ارزیابی زیرگروه‌ های مختلف BCP و تمایز بین سلول ‌های BCP و BCP-ALL را فراهم می سازند. با این وجود تمایز دقیق این سلول‌ ها در برخی موارد با استفاده از مارکرهای ذکرشده به تنهایی کافی نبوده و بدین ترتیب مارکرهای دیگری براساس آزمایش های متعدد مورد استفاده قرار می گیرند. از آنجاییکه CD66c و CD123 دارای بیان منفی در سلول‌های نرمال / فعال BCP می باشند می توان از آن ها به صورت ترکیب در کانال PE به عنوان کنترل منفی استفاده نمود. پس از بررسی ها و آزمایش های مختلف مارکرهای CD66c، CD123، CD38 و CD81 جهت تمایز هرچه بهتر بین سلول های نرمال / فعال  و سلول های بدخیم BCP در پنل مورد نظر گنجانده شد. علی رغم نتایج قابل قبول به دست آمده با مارکرهای ذکر شده، در برخی موارد نتایج آنالیزها تمایز کافی میان سلول های  نرمال / فعال BCP و سلول های بدخیم BCP را نشان نمی دهد. بدین منظور مارکرهای CD73 و CD304 به عنوان مارکرهای تکمیلی به پنل مورد نظر اضافه گردید. کیت مورد نظر دارای یک ویال حاوی پودر لیوفیلیزه و مناسب برای 20 تست می باشد. پروتکل استاندارد جهت ردیابی BCP-ALL-MRD نتایج ایمونوفنوتایپینگ فلوسایتومتری به میزان زیادی وابسته به پروتکل آماده سازی نمونه می باشد. به همین دلیل تیم EuroFlow^TM  برای هر پنل پروتکل های استانداردی جهت استفاده در دستگاه هایی با 3 لیزر طراحی نموده و در موارد خاصی مشابه بیماری BCP-ALL MRD ، جهت ردیابی تعداد کم سلول ها با حساسیت بالا به کار گرفته می شود. هدف EuroFlow^TM  دستیابی به حساسیتی قابل مقایسه با روش RQ-PCR  در تشخیص MRD می باشد که بدین منظور بایستی تعداد حداقل 5 میلیون سلول به صورت کلی در یک تیوب بررسی گردد. در اوایل فاز درمان، تعداد سلول های موجود در نمونه مغز استخوان پایین بوده و درصورت استفاده از روش های استاندارد امکان دسترسی به تعداد سلول مورد نیاز فراهم نمی گردد. از این‌رو EuroFlow^TM   اقدام به تولید یک محلول لیز اریتروسیت (Erythrocyte BulkLysis^TM) نموده که پس از استفاده از آن و از بین رفتن حجم بالایی از اریتروسیت های موجود در نمونه مغز استخوان، باقی لکوسیت ها در حجم کمی از بافر شستشوی مناسب جهت رنگ آمیزی آماده می گردند. این پروتکل جدید امکان رنگ آمیزی 10 میلیون سلول در 100 میکرولیتر نمونه در هر تیوب را فراهم می سازد. آنالیز نتایج با نرم افزار INFINCYTE^TM تصویر زیر نشان دهنده نتایج بررسی سلول های نامطلوب (نقاط قرمز) در میان جمعیت سلول های B نرمال (نقاط خاکستری) می باشد. مثال های زیر نشان دهنده دو نمونه متفاوت بوده که سلول های B نامطلوب با استفاده از مارکرهای CD66c⁺CD123 و CD73⁺CD304 به ترتیب در تیوب های 1 و 2 ردیابی شده اند. بدون وجود این مارکرها امکان ردیابی سلول های غیرنرمال در میان جمعیت سلول های نرمال به راحتی از بین می رود چراکه مارکرهای ایمونوفنوتیپی این سلول ها تا حدودی مشابه سلول های B نرمال می باشد.   منابع

 

1. Theunissen P, et al. Standardized flow cytometry for highly sensitive MRD measurements in B-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2017 Jan 129 (3): 347–357.
2. Theunissen P, et al. detailed immunophenotyping of B-cell precursors in regenerating bone marrow of acute lymphoblastic leukaemia patients: implications for minimal residual disease detection, British Journal of Haematology. 2017 Jul; 178 (2):257-266.
3. Edited by Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, Thiele J. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissue, revised 4th edition, volume 2. 2017.
4. Van Dongen JJ, et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes, Leukemia. 2012 Sep; 26 (9):1908-1975.
5. EuroFlow Consortium website: www.euroflow.org.