در این مطلب به روش استفاده از آنتی‌بادی های ایمونوهیستوشیمی (IHC) پرداخته و پروتکل و راهنمای این تکنیک را مرحله به مرحله بررسی خواهیم کرد.

       1) مرحله آماده سازی بافت:

آماده سازی نمونه شامل چند مرحله جداگانه می باشد:

فیکس کردن بافت: هدف از فیکساسیون بافت حفظ ساختار سلولی و مورفولوژی بافت ها می باشد. پروسه فیکساسیون بافت طبق مراحل زیر انجام می گیرد.

A) غوطه ور ساختن بافت در پارافین (Paraffin- Embedded- Tissue)

  1. در این مرحله باید به کمک فرمالین بافت را فیکس نماییم. بدین ترتیب بافت مورد نظر را به مدت چند ساعت در فرمالین غوطه ور می نماییم (زمان بسته به نوع و ضخامت بافت متغیر می باشد). عمومأ بهترین زمان بین 18 تا 24 ساعت می‌باشد. بعد از فیکس کردن بایستی بافت در پارافین غوطه ور گردد.
  2.  به دلیل عدم حلالیت پارافین در آب،. بایستی قبل از غوطه ‌ور کردن بافت در پارافین مرحله آب‌گیری را انجام دهیم. بدین ترتیب از اتانول در دمای اتاق استفاده می‌کنیم. بافت را سه مرتبه هربار به مدت نیم ساعت در اتانول 70%، 90% و 100% قرار می دهیم.
  3. بعد از انجام پروسه آب‌گیری باید مواد از روی بافت شسته شوند که برای این کار از Xylene استفاده می‌کنیم. پس از شستشوی اتانول، بافت را در پارافین به مدت 20 دقیقه غوطه ور می‌سازیم و سپس بافت را در معرض سرما قرار می دهیم تا سفت شود. این پروسه معمولا از 20دقیقه تا یک شبانه‌ روز متغیر می باشد. پس از سفت شدن بافت، با استفاده از دستگاه میکروتوم بافت را به قطعات 15-5 میکرومتر برش می‌زنیم.

B) پارافین زدایی

پس ازغوطه ور ساختن بافت ها در پارافین و برش زدن با میکروتوم ، بایستی پارافین را از بافت جدا کنیم، چرا که از این مرحله به بعد به بافت خالص نیاز داریم . برای این کار بافت همراه با پارافین را به لام های شارژ شده دارای بار مثبت منتقل می‌کنیم (وجود بار مثبت سبب تسهیل اتصال بافت به لام می گردد.) پس از چسبیدن بافت به لام بایستی پارافین را از بافت جدا کنیم که نیاز به آبدهی بافت می باشد. مرحله آبدهی برعکس مرحله آبگیری انجام می شود. این مرحله در جوابدهی بسیار مؤثر می باشد.

  1. اسلایدها را دو مرتبه هربار به مدت 5 دقیقه در xylene غوطه ور می کنیم تا شسته شود.
  2. اسلایدها را در اتانول 50%، %75، 95% و 100%  (هرکدام به مدت 5 دقیقه) غوطه‌ور می کنیم.
  3. بافت را با آب استریل و یا بافر شستشو کاملا می‌شوییم.

 

       2) Antigen Retrieval:

به دلیل حفظ کیفیت کار و عدم بروز رنگ آمیزی غیر اختصاصی از خشک شدن اسلایدها به صورت کامل جلوگیری نمایید. قبل از ورود به مرحله ی اضافه کردن آنتی بادی ها بایستی مرحله Antigen Retrieval   انجام شود.

در این مرحله نمونه بافت را با زمان مشخص شده برای هر آنتی بادی (20 دقیقه در 95 درجه سانتی گراد با استفاده از مایکروویو، دستگاه بخارو یا اتوکلاو حرارت می دهیم ). بافرهایی که در این مرحله استفاده می گردد عبارتند از:  سدیم سیترات (PH=6)، PH=8) EDTA) و Tris EDTA (PH=9).

بافر متداول شرکت Master Diagnostic  انجام این مرحله بافر  EDTA می باشد.

       3) Blocking:

اگر مبنای شناسایی آنتی ژن های مورد نظر براساس استفاده از آنتی بادی متصل به آنزیم HRP  باشد بایستی از این روش استفاده نمود تا آنزیم های درونی موجود در بافت غیرفعال گردد. جهت اطمینان از فعالیت پراکسیداز درونی بافت ماده DAB که سوبسترای HRP می‌باشد را  به بافت اضافه می‌کنیم. قهوه‌ای شدن بافت بیانگر فعالیت پراکسیدازی درونی آن می‌باشد. جهت صحت انجام کار بایستی این پراکسیدازها را بلاک نمود .

  1. پروکسیداز بلاکر، آب اکسیژنه یا H2O2 که بهترین ماده بلاک کننده می‌باشد را به مدت 10-15 دقیقه به بافت اضافه می کنیم.
  2. سپس بافت ها را با بافر  PBSشستشو می دهیم.

       4) Immuno-staining:

این مرحله شامل اضافه کردن آنتی بادی های اولیه و ثانویه به بافت می‌باشد.

مرحله اول در اضافه کردن آنتی بادی اولیه انتخاب آنتی بادی با غلظت مناسب و پروسه انکوباسیون صحیح می باشد.

  1. مقدار مشخصی از آنتی بادی اولیه رقیق شده را به ‌صورت قطره قطره به تمامی نواحی بافت فیکس شده بر روی لام اضافه می کنیم. حال با توجه به مدت زمان انکوباسیون (حدود 10 الی 20 دقیقه بر اساس  پروتکل آنتی بادی مورد نظر و دمای لازم)، بافت را با آنتی بادی انکوبه می نماییم.
  2. بعد از اتمام زمان انکوباسیون، اسلاید را با PBS  سرد به مدت 5 دقیقه شستشو می دهیم .
  3. آنتی بادی ثانویه را اضافه کرده و در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه انکوبه می کنیم..
  4. لام را با PBS  سرد  به مدت 5 دقیقه شستشو می دهیم.

لاذم به ذکر است که آنتی بادی های ثانویه کمپانی Master Diagnostic دو مرحله ای بوده و در 3 حجم مختلف می باشد.

 

       5) Counter-staining:

Counter-staining به معنای رنگ آمیزی سلول های بافت می باشد. با این کار می‌توان تضاد رنگی بین محل هایی که دارای پروتئین مورد نظر و نواحی فاقد آن می‌باشند را ایجاد نمود. در این صورت شناسایی پروتئین مورد نظر به راحتی انجام می‌گیرد. انتخاب رنگ بستگی به امکانات آزمایشگاه دارد. از جمله رایج ترین رنگ ها در این تکنیک هماتوکسیلین می باشد. مراحل انجام کار به شرح زیر می باشد:

  1. لام باید به مدت 2-3 دقیقه در هماتوکسیلین قرار گیرد .
  2. سپس با PBS و یا آب استریل به مدت 10 دقیقه شسته شود.

 

       6) Mounting:

Mounting به معنای محکم کردن و محافظت کردن بافت می باشد. این مرحله برای حفظ نمونه و بهبود کیفیت عکس در زیر میکروسکوپ بسیار مفید و ضروری می باشد. اگر این مرحله به درستی انجام شود در انتها عکس و لکه هایی که می بینیم خیلی واضح بوده و دارای کنتراست بیشتری می‌باشد.

 

شرکت سماتشخیص‌آریا ارائه‌دهنده‌ی انواع آنتی‌بادی های ایمونوهیستوشیمی و کیت های Detection از شرکت Master Diagnostica اسپانیا می‌یاشد. شما میتوانید برای کسب اطلاعات بیشتر به بخش محصولات مراجعه نمایید.