مقدمه:
در فرایند ایجاد و پیشرفت ضایعات پری‌اپیکال (اطراف ریشه دندان)، عوامل التهابی و ضدالتهابی گوناگون و همچنین انواع مختلفی از سلول‌ها نقش دارند. این پژوهش با هدف ارزیابی ایمونواکسپرسیون فاکتور رشد تبدیل‌شونده (TGF-β1) و CD68 انجام شده است تا نقش و همبستگی‌های احتمالی این دو روشن شود. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل بافت‌شناسی نیز به منظور ارزیابی شدت نفوذ التهابی در نمونه‌های ضایعات مزمن پری‌اپیکال انجام شد.
روش‌ها:
از پنجاه فرد مبتلا به ضایعات مزمن پری‌اپیکال نمونه‌های بافتی جمع آوری شد مشتمل بر ۲۵ کیست رادیکولار (RCs) و ۲۵ گرانولوم پری‌اپیکال (PGs) به همراه نمونه‌های کنترلی از پالپ چهار دندان سالم آسیای سوم. بافت‌شناسی و دسته‌بندی شدت نفوذ سلول‌های التهابی بررسی شد. سپس، آنالیز ایمونوهیستوشیمیایی (ایمنی‌بافتی) برای بررسی نشانگرهای TGF-β1 و CD68 همراه با ارزیابی مورفومتریک (اندازه‌گیری‌های کمی بافتی) انجام شد.
نتایج بررسی‌ها:
در گروه کنترل، بافت پالپ دندان‌ها طبیعی و بدون التهاب بود؛ در حالی که در گرانولوم‌های پری‌اپیکال (PGs) و کیست‌های رادیکولار (RCs) التهاب شدید مشاهده شد (به‌ترتیب به میزان ۴ و ۳) که غالباً شامل ماکروفاژها، سلول‌های پلاسما و لنفوسیت‌ها بود. بررسی ایمونوهیستوشیمیایی نشان داد که میزان TGF-β1 و CD68 در PGs و RCs به‌طور قابل‌توجهی بیشتر از گروه کنترل بود (P < 0.001). همچنین، این دو نشانگر در PGs نسبت به RCs به‌طور معنی‌داری بالاتر بود (P < 0.001) . با این حال، بین این دو نشانگر رابطه معکوس مشاهده شد (P < 0.05).
مواد و روش‌ها
نمونه‌های بافتی
در این مطالعه، ۲۵ نمونه کیست رادیکولار (RC) و ۲۵ نمونه گرانولوم پری‌اپیکال (PG) از افراد جمع‌آوری شد. بیماران به‌صورت تصادفی از میان افرادی انتخاب شدند که به بخش اندودنتیکس دانشکده دندان‌پزشکی دانشگاه قاهره مراجعه کرده بودند و به دلیل وجود ضایعات مزمن پری‌اپیکال که با درمان ریشه معمول بهبود نیافته بودند، نیاز به جراحی پری‌اپیکال داشتند. معاینه‌های بالینی و رادیولوژیک بر روی دندان‌های آسیب‌دیده انجام شد.جمعیت مورد مطالعه شامل مردان و زنان در بازه سنی ۲۰ تا ۴۰ سال بود که هیچ‌گونه بیماری سیستمیک نداشتند، باردار نبودند و طبق پرونده پزشکی‌شان، دارویی مصرف نمی‌کردند. اطلاعات مربوط به ویژگی‌های جمعیت‌شناختی بیماران (جنسیت و سن) و خصوصیات بالینی آن‌ها (مکان آناتومیکی ضایعه، علائم، و نتایج رادیوگرافی) به همراه سوابق بیوپسی ثبت شد.
گروه کنترل شامل پالپ دندان سالم از چهار نفر بود که به دلایل درمانی، دندان عقل سالم آن‌ها به‌صورت جراحی خارج شد. این بافت‌ها هیچ نشانه‌ای از التهاب نداشتند و به‌عنوان نمونه‌های کنترل استفاده شدند. پالپ دندان به دلیل این که بافتی همبند با ویژگی‌های خاص و متفاوت از سایر بافت‌های دهانی است، امکان مقایسه دقیق‌تری از نشانگرهای التهابی در ضایعات پری‌اپیکال را فراهم می‌کند، بدون آنکه خود دارای التهاب قبلی باشد. تشخیص ضایعات پری‌اپیکال بر پایه ارزیابی‌های بالینی و بافت‌شناسی انجام شد. نمونه‌های بیوپسی ضایعات پری‌اپیکال پس از برداشت، در محلول خنثی فرمالین ۱۰% تثبیت شدند. سپس با استفاده از غلظت افزایشی الکل اتیلیک دهیدراته شده (آب‌زدایی) و با زایلن، شفاف‌سازی گردیدند. پس از این مراحل، بافت‌ها در پارافین تازه جاسازی شده و برش‌هایی با ضخامت چهار میکرون از آن‌ها تهیه شد. این برش‌ها مراحل زیر را پشت سر گذاشتند:
کیست‌های رادیکولار (RC) با استفاده از معیارهای زیر شناسایی شدند:
1. وجود ضایعه‌ای در ناحیه پری‌اپیکال دندان غیرزنده (بدون پالپ فعال / نکروزشده)،
2. شناسایی حفره‌ای حاوی مایع یا ماده‌ای نیمه‌مایع در حین جراحی،
3. تأیید بافت‌شناسی مبنی بر وجود اپیتلیوم سنگفرشی لایه‌نشده (غیرکراتینه‌شده) که به‌صورت جزئی یا کامل دیواره کیست یا نمونه بافتی را پوشانده باشد.
از سوی دیگر، گرانولوم‌های پری‌اپیکال (PG) وجود داشتند که از بافت گرانولوماتوزی تشکیل شده بودند؛ شامل تعداد زیادی سلول التهابی نفوذی از جمله لنفوسیت‌ها، ماکروفاژها، لکوسیت‌های چند‌هسته‌ای (پلی‌مورفونوکلئر) و سلول‌های پلاسما بدون آن که هیچ سلول اپیتلیالی در آن دیده شود. نمونه‌های بیوپسی ضایعات پری‌اپیکال پس از برداشت، در محلول خنثی فرمالین ۱۰% تثبیت شدند. سپس با استفاده از غلظت افزایشی الکل اتیلیک دهیدراته شده (آب‌زدایی) و با زایلن، شفاف‌سازی گردیدند. پس از این مراحل، بافت‌ها در پارافین تازه جاسازی شده و برش‌هایی با ضخامت چهار میکرون از آن‌ها تهیه شد. این برش‌ها مراحل زیر را پشت سر گذاشتند:
بررسی بافت شناسی
رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) برای بررسی ویژگی‌های بافت‌شناسی نمونه‌ها و ارزیابی میزان نفوذ سلول‌های التهابی انجام شد.
تحلیل مورفولوژیک
شدت نفوذ سلول‌های التهابی با استفاده از یک روش امتیازدهی کمی ارزیابی شد. در این روش، شمارش سلول‌های التهابی در ده ناحیه مختلف از برش‌های بافتی با بزرگنمایی ۴۰۰ برابر انجام گرفت. واکنش التهابی بر اساس تعداد و پراکندگی سلول‌های التهابی در هر میدان دید، به صورت چهار سطح امتیازدهی شد:
- امتیاز ۱: تعداد بسیار کم یا بدون سلول التهابی (فاقد واکنش)،
- امتیاز ۲: کمتر از ۲۵ سلول التهابی (واکنش خفیف)،
- امتیاز ۳: بین ۲۵ تا ۱۲۵ سلول (واکنش متوسط)،
- امتیاز ۴: بیش از ۱۲۵ سلول (واکنش شدید).
برای رعایت بی طرفی و جلوگیری از سوگیری، تمام ارزیابی‌های امتیازی توسط یک ارزیاب بی‌طرف و بدون اطلاع از نوع نمونه انجام شد.
بررسی ایمونوهیستوشیمی
پس از خارج‌سازی پارافین، برش‌های بافتی در محلول بافر فسفات سالین (PBS) شست‌وشو داده شده و جهت بازیابی آنتی‌ژن، در محلول سیترات با pH معادل 6.0 قرار گرفت. به منظور مهار فعالیت پراکسیدازهای درون‌زاد، نمونه‌ها با محلول پراکسید هیدروژن قرار داده شدند. لکه‌گیری غیرمرتبط پس‌زمینه برش‌ها، با انکوباسیون در آلبومین سرم گاوی انجام شد. برش‌ها به مدت یک ساعت در دمای اتاق با آنتی بادی‌های زیر قرار گرفتند:
- آنتی‌بادی TGF-β1 مونوکلونال، موشی، ضد انسان، رقیق‌سازی: 1:1000، محصول AbD Serotec رومانی، کد MCA797T،
- آنتی‌بادی CD68 مونوکلونال، موشی، ضد انسان، رقیق‌سازی: 1:200، محصول DAKO آمریکا، کد M0814.
برش‌ها پس از شستشو با بافر، به مدت 30 دقیقه دیگر در معرض آنتی‌بادی‌های ثانویه بیوتینیله شده (DAKO – کد K0492) قرار گرفتند، سپس شسته شدند. برای مشاهده رنگ، از محلول دی‌آمینوبنزدین (DAB) به عنوان ماده رنگ‌زا استفاده شد. همچنین رنگ هماتوکسیلین مایر به عنوان رنگ مکمل به کار رفت و PBS به عنوان کنترل منفی استفاده شد.
تحلیل مورفومتریک
تفسیر برش‌های رنگ‌آمیزی شده با استفاده از سیستم تحلیل تصاویر کامپیوتری مجهز به نرم‌افزار Leica Quin 500 (محصول Leica Microsystems سوئیس) انجام شد تا درصد ناحیه رنگ‌پذیری ایمونوهیستوشیمی اندازه‌گیری شود. برش‌های بافتی با استفاده از میکروسکوپ نوری (با بزرگنمایی 100×) برای شناسایی نواحی حاوی سلول‌های ایمنوراکتیو مورد بررسی قرار گرفتند و سپس میدان‌های انتخاب‌شده در بزرگنمایی 400× مورد ارزیابی قرار گرفتند. نواحی با سلول‌های ایمنوراکتیو در 10 میدان میکروسکوپی نشانگر و متوالی در مکان‌های مختلف، تجزیه و تحلیل شدند. در نهایت، داده‌های به‌دست‌آمده از آنالیز کامپیوتری برای مقایسه میانگین درصد ناحیه رنگ‌پذیری بین گروه کنترل و گروه‌های آزمایشی (ضایعات) به روش آماری تحلیل شد.
تحلیل آماری
داده‌های به‌دست‌آمده از آنالیز تصویر با استفاده از روش‌های آماری مورد بررسی قرار گرفت و نتایج به‌صورت میانگین و انحراف معیار گزارش شد. برای بررسی نرمال بودن توزیع داده‌ها، از آزمون کولموگروف–اسمیرنوف (Kolmogorov–Smirnov) استفاده شد. طبق نتایج بدست‌آمده، داده‌ها توزیع نرمال دارند (پارامتریک)؛ بنابراین، برای مقایسه میان سه گروه در هر مارکر، از آزمون آنووا (ANOVA) استفاده شد. در ادامه، برای مقایسه‌های دو به دو بین گروه‌ها، از آزمون پُست هوک توکی (Post Hoc Tukey) بهره گرفته شد.سطح معنی‌داری آماری برابر باp ≤ 0.05 در نظر گرفته شد.برای بررسی ویژگی‌های جمعیت‌شناسی و بالینی در گروه‌های PG و RC، از آزمون فیشر (Fisher’s Exact Test) استفاده شد. همچنین، تفاوت‌های سنی بین دو گروه با استفاده از آزمون T مستقل بررسی شد. برای آنالیز داده‌های غیر پارامتریک مربوط به امتیاز شدت التهاب بافتی (morphological analysis score) از آزمون کروسکال-والیس (Kruskal-Wallis) استفاده شد. برای بررسی‌ارتباط‌بین‌متغیرها، از ضریب همبستگی پیرسون (Pearson’s correlation coefficient) استفاده شد.
نتایج
داده‌های جمعیت شناسی
- بررسی بیماران دارای گرانولومای پری‌آپیکال (PG) نشان داد که شیوع در زنان بیشتر بود (n = 19 معادل 76٪)
- میانگین سنی بیماران PG برابر با25.5 ± 5 سال بود.
- اکثر بیماران بدون علامت (n = 17 معادل 68٪) بودند.
- در همه موارد، ضایعه به‌صورت رادیولوسنسی (تیرگی در رادیوگرافی) دیده شد (n = 25 معادل 100٪).
- اندازه ضایعه کمتر از 1 سانتی‌متر بود (n = 21 معادل 84٪).
- محل ضایعه بیشتر در ناحیه قدامی ماگزیلا (فک بالا) قرار داشت (n = 18 معادل 72٪).
در مقابل:
- از میان 25 مورد کیست رادیکولار (RC)، شیوع در مردان بیشتر بود (n = 13 معادل 52٪).
- میانگین سنی این بیماران برابر با 32.5 ± 4.77 سال بود.
- اغلب بیماران بدون علامت بودند (n = 20 معادل 80٪).
- در تمامی موارد، ضایعه به‌صورت رادیولوسنسی دیده شد (n = 25 معادل 100).
- اندازه ضایعه برابر یا بیشتر از 1 سانتی‌متر بود (n = 19 معادل 76).
- محل عمده ضایعه در ناحیه قدامی ماگزیلا قرار داشت (n = 16 معادل 64٪).