تکنیک فلوسایتومتری

امروزه به کارگیری تکنولوژیهای مدرن به جهت افزایش سرعت، دقت و سهولت انجام آزمایشات، روز به روز در حال گسترش است.

تکنیک فلوسایتومتری توسط ایمونولوژیست هایی ابداع شد که تلاش میکردند جمعیت های خالص سلول ها را از یکدیگر جدا کنند و پس از تکثیر آنها در محیط کشت سلولی، نقش هر سلول را در سیستم ایمنی بررسی کنند .

فلوسایتومتری روشی دقیق و با کارایی بالاست که برای شناسایی سلول ها ( ذرات) و ارزیابی خصوصيّات آنها به كار می رود. هر سلولي بر حسب نوع و تخصصي كه بر عهده دارد مولكولهاي مختص به خود را بيان می کند، یعني همة ژن ها در همه سلول ها بيان نميشوند بلكه برحسب وظيفه اي كه در طي تمايز بر عهده سلول گذاشته شده است و بر حسب محيطي كه در آن قرار می گیرد، هر سلولي خود انتخاب می کند كه در پاسخ به شرايط محيطي كدام ژن را فعال سازد. بنابراين رديابي پروتئین های سلولي حاصل از بيان ژن ها هم در سطح و هم در درون سلول مي تواند وسيله اي بسيار مفيد براي شناسايي سلول باشد. مولكولهاي سطحي سلول ها تحت نام عمومي (CD) Cluster Differentiation شناخته مي شود و براي رديابي آنها از آنتی بادی های مونوكلونال كونژوگه با فلوروكروم استفاده مي شود. برای نمونه ماركرهاي سطحي سلول هاي پلاکت عبارتند از CD51 ,CD41 ,CD61 و آنتی بادی هايي با همين نام قادرند اين مولكول ها را در سطح سلول شناسايي کنند. سلول ها از اجزای مختلفي مثل غشاء سيتوپلاسمي، غشاء هسته اي، هسته و سيتوپلاسم تشكيل مي شود و تقريبا همه مولكولهاي موجود در قسمتهاي مختلف سلول را می توان با استفاده از فلوسايتومتري رديابي و تعيين مقدار کرد. معمولاً مولكول هاي سطحي موجود در غشاء سيتوپلاسمي به راحتي در دسترس آنتی بادی قرار می گیرد ولي براي رسيدن آنتي بادي يا ماده فلورسانس به مولكول هاي دروني سلول، رو شهاي مطمئن و موثري لازم است. تکنیک فلوسایتومتری بر اساس پراکنده سازی نور توسط سلول های مورد آزمایش و انتشار فلورسانس از آنها استوار است. نشر فلورسانس با استفاده مستقیم از فلوروكرو مهای متصل شونده به اجزای سلولی یا ترکیبی از رنگ فلورسنت با آنتی بادی های مونوکلونال حاصل می شود. این آنتی بادی های کونژوگه با فلورسانس می توانند مولکول های سطحی و یا ترکیبات داخلی سلول ها را ردیابی کرده و به آنها متصل شوند و شناسایی انواع سلول های موجود در یک جمعیت سلولی متنوع را توسط فلوسایتومتری امکان پذیر می سازند. فلوسایتومتری در دهه اخیر در آزمایشگاه های تشخیص طبی، جهت تشخیص انواع لوسمی های خونی، بیماری های نقص سیستم ایمنی )برای مثال تست DHR به روش فلوسایتومتری جهت بررسی توانایی فاگوسیتوز  نوتروفیل ها در کودکان و افراد مبتلا به بیماری های گرانولو ماتوز مزمن (در انسان به کار گرفته می شود.  همچنین در بخش های پژوهشی، برای تعیین پیش آگهی بیمار یها و ارزیابی درمان بدخیمی ها استفاده می شود.

اصول آزمایش و تهیه سلول برای فلوسایتومتری:

قدم اول بعد از تهیه نمونه، ساختن سوسپانسیون یکنواخت است. نمونه خون در حالت معمول حاوی سلو لهای منفرد است که در پلاسمای خون به صورت معلق هستند. نمونه ای به دست آمده از مغز استخوان را می توان  با پی پت کردن مکرر به صورت سوسپانسیون سلو لهای منفرد در آورد.  درنمونه بافت های جامد و لنفوئیدی، اتصالات سلول به سلول یا سلول به بستر باید شکسته شود و سلو لها کاملا آزاد شوند.. قدم دوم این است که تا زمان آنالیز نمونه، خصوصیات و عملکرد سلو لهای تحت بررسی باید در حالت طبیعی و دست نخورده حفظ شود. پس از تهیه سوسپانسیون مناسب، سلولها باید با آنتی بادی های مونوکلونال کونژوگه نشاندار، مجاور شوند. روش نشاندار کردن تحت تاثیر فاکتورهای زیادی قرار می گیرد از جمله میزان اختصاصی بودن آنتی بادی و غلظت آنتی ژن در سطح یا داخل سلول. محیط اطراف سلولها معمولا با pH برابر ۳/ ۷ و غلظت سلولی بین 10⁵ تا 10⁶ سلول در هر میلی لیتر تهیه می شود و تحت چنین شرایطی سلولها به صورت یک به یک از مقابل محور تابش نور لیزر عبور خواهند کرد. چنانچه واکنشی صورت گرفته باشد سطح سلول دارای خاصیت فلورسانس شده و با جذب نور لیزر برانگیخته و طول موج بلندتری بازتاب می کند. نور بازیافتی در زوایای مختلف مورد سنجش قرار می گیرد. معمولا حجم کمی از نمونه( 0/2-1ml) برای آنالیز لازم است. قطر سلولهای ارزیابی شده باید در محدوده ۱ تا ۳۰ میکرون باشد. فلوسایتومتری های معمولی که جهت آنالیز سلولهای خونی طراحی شده اند برای ارزیابی ذرات کوچک تر از 1 میکرون حساسیت لازم را ندارند، از طرفی وجود ذرات درشت تر از ۳۰ میکرون، موجب انسداد جریان مایع در دستگاه خواهد شد. عاملی که فلوسایتومتری را به عنوان یک تکنیک فوق العاده در مطالعات کلین کیی در می آورد این است که سرعت جریان نمونه ) ۵ تا ۵۰ متر در ثانیه(  امکان جمع آوری اطلاعات مربوط به ۵۰۰۰ تا ۵۰۰۰۰ سلول را در هر ثانیه فراهم می نماید.   شرکت سماتشخیص آریا ارائه دهنده ی انواع کیت ها و آنتی بادی های فلوسایتومتری از کمپانی Cytognose می باشد. شما میتواینید برای مشاهده ی انواع محصولات فلوسایتومتری به بخش محصولات مراجعه نمایید.